Cellufine Phosphate | Zur Reinigung von DNA-bindenden Proteinen und T7-RNA-Polymerase

Affinitätschromatographie

Cellufine^TMPhosphate

Zur Reinigung von Nukleinsäure-bindenden Proteinen wie der T7RNA-Polymerase, dem synthetisierenden Enzym für mRNA-Arzneimittel.

Cellufine Phosphate ist ein Chromatographie-Füllstoff mit Affinitätsaktivität für Enzyme und Nukleinsäure-bindende Proteine. Phosphatgruppen sind auf sphärischen Zellulosepartikeln mit hoher mechanischer Festigkeit immobilisiert. T7-RNA-Polymerase, das synthetisierende Enzym für mRNA-Arzneimittel, kann für Nukleinsäure-bindende Proteine mit Cellufine Phosphate effizient gereinigt werden.

Abb. 1: Chemische Struktur von Cellufine Phosphate

Merkmale
Basisträger	Zellulose
Ligand	Phosphatgruppe
Ligandenkonzentration	0,3 - 0,8meq/ml
Proteinadsorptionsmenge	≧ 20mg/ml-gel (Lysozym)

Beispiel für die Reinigung der T7-RNA-Polymerase

T7-RNA-Polymerase ist ein äußerst wichtiges RNA-Syntheseenzym, das zur Synthese von mRNA aus Matrizen-DNA in der In-vitro-Transkriptionssynthese verwendet wird. In diesem Fallbeispiel wurde hochreine T7-RNA-Polymerase mithilfe eines zweistufigen Chromatographieverfahrens gereinigt, wobei zunächst Cellufine MAX DEAE zur Rohreinigung und anschließend eine Affinitätsreinigung mit Cellufine Phosphate verwendet wurde.

Abb. 2: Reinigung der T7-RNA-Polymerase mit Cellufine Phosphate

Nach der Reinigung mit Cellufine MAX DEAE wurde es mit Cellufine Phosphate gereinigt. T7-RNA-Polymerase ist in der rot dargestellten EL2-Fraktion akkumuliert.

Tabelle 2: Rückgewinnungsrate der T7-RNA-Polymerase in jeder Fraktion nach der Säule

Fraktion	Enzymaktivität (Unit/protein)	Erholungsrate der Enzymaktivität (%)	Proteinwiederherstellungsrate (%)
Probe laden	94.043	100	100
Durchgangsfraktion	2.763	1,8	59,8
Elutionsfraktion	267.034	70,2	24,7

Tabelle 1 zeigt die Enzymaktivitätsrate und die Proteinrückgewinnungsrate nach der Säulenreinigung mit Cellufine Phosphate (Abb. 1). Die Aktivität der T7RNA-Polymerase in der Elutionsfraktion zeigte mit 70,2 % eine hohe Rückgewinnungsrate. Die Proteinmenge sank auf 24,7 %, was darauf hindeutet, dass Verunreinigungen effizient entfernt wurden.

Abb. 3: SDS-PAGE nach der Reinigung mit Cellufine Phosphate

1: Lysat, 2: Ammoniumsulfat-Fällung, 3: Cellufine MAX DEAE-Elutionsfraktion, 4: Cellufine Phosphat-Elutionsfraktion, 5: Kommerzielle Kontrolle

Der Reinigungsgrad wurde durch SDS-PAGE unter Verwendung von Fraktionen bewertet, die aus dem jeweiligen Reinigungsprozess mit Cellufine MAX DEAE und Cellufine Phosphate erhalten wurden. Bei jedem Chromatographieschritt werden Verunreinigungen entfernt, und im Schritt mit Cellufine Phosphate kann die T7-RNA-Polymerase bis auf ein nahezu einzelnes Band gereinigt werden.

Poreneigenschaften von Cellufine Phosphate

Cellfine Phosphate Pore size characteristics — Abb. 2Kalibrierungsschnitzel aus Cellulosephosphat und einem herkömmlichen Cellulosephosphat.

Cleaning-in-Place (CIP)-Stabilität

Cellufine Phosphate ist in wässriger 0,2 M NaOH-Lösung stabil und kann wiederholt verwendet werden.

Testdaten zur wiederholten Verwendung von Cellufine Phosphat, Clean-in-Place-Test mit 0,2 M NaOH — Figure3CIP condition : 0,2mol/L NaOH 3CV 0,05M phosphate buffer, pH7 5CV (repeat)

Reinigungsdaten des DNA-bindenden Proteins RusA D70N unter Verwendung von Cellufine-Phosphat — Abb. 4Verwendung von Cellufinphosphat bei der Reinigung von Rus A D70N

Betriebsbedingungen

Spalte: 1,6x10cm (20ml)
Fließrate: 3ml/min( 90cm/h )
Probe: 7,5mg RusA D70N (Probe nach Reinigung des mit Heparin immobilisierten Trägers)
Gradient: 200ml,　0,1Ｍ→1,3M NaCl in 50mM tris-HCl pH 8,0

SDS-PAGE

Gel: Novex 4-12%BT gel used with MES-SDS running buffer (Invitrogen)
Spurinformationen: 1 Extrakt nach Zellentfernung
2 Nicht adsorbierter Anteil an Heparin-immobilisiertem Träger
3 Heparin-immobilisierte Trägeradsorptionsfraktion RusA
4-6 Elutionsfraktion nach Adsorption an Cellufine Phosphate
7 RusEine reine Probe
8 Marker 12 MW-Standard (Invitrogen)

Verweise

Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 00, No. 00 1–8
Rachel Macmaster, Svetlana Sedelnikova, Patrick J. Baker, Edward L. Bolt1,Robert G. Lloyd1 and John B. Rafferty
RusA Holliday junction resolvase: DNA complexstructure—insights into selectivity and specificity
This data was carried by courtesy of Dr. Svetlana Sedelnikovaof the Sheffield university.

Proteintrenneigenschaften

Durch Veränderung der Salzkonzentration ermöglicht Cellufine Phosphate die Proteintrennung. Es verhält sich wie ein Kationenaustauscher, neigt jedoch dazu, bei höheren Salzkonzentrationen besser als typische Kationenaustauscher zu eluieren.

Spalte: ID 1,1 cm – H 10 cm
Fließrate: 2 ml/min (126cm/h)
Äquilibrierungspuffer: 0,01 M Acetatpuffer, pH 4,8
Elutionspuffer: 0 → 1 mol/L NaCl Gradient

Cellufine^TMPhosphate

Auch Individualisierungen und Sonderanfertigungen
können entwickelt werden.

Wir können auch Sorten nach Kundenwunsch entwickeln, sprechen Sie uns daher gerne an.

Kontakt