CellufineTMFormyl
Bitte verwenden Sie es zur Immobilisierung von Liganden wie monoklonalen Antikörpern, polyklonalen Antikörpern, Antigenproteinen, Peptiden usw.
Bei den bisher verwendeten, mit Ligandenimmobilisierungsträger auf Agarosebasis ist der Basisträger weich, sodass es schwierig war, sie in große Säulen zu füllen, die in der Industrie verwendet werden. Darüber hinaus kommt es bei Trägern mit CNBr als Ligand zu einer instabilen Immobilisierung des Liganden, und es besteht die Gefahr einer Abtrennung des Liganden. Cellufine Formyl ist ein Immobilisierungsträger, der über äußerst stabile Formylgruppen (Aldehydgruppen) verfügt und über kovalente Bindungen zu starken Reaktionen mit Proteinliganden fähig ist. Da es rein sphärisch ist und über Poren verfügt, die groß genug sind, damit Proteine leicht eindringen können, weist es ideale physikalische Eigenschaften als Träger für die Immobilisierung von Liganden auf. Es verfügt außerdem über eine mechanische Festigkeit, die den Einsatz in großen Säulen ermöglicht.
Merkmale
- Es kann nicht nur im Labormaßstab, sondern auch im Industriemaßstab eingesetzt werden und verfügt über eine mechanische Festigkeit, die den Einsatz bei hohen Fließgeschwindigkeiten ermöglicht.
- Da der immobilisierte Träger und der Ligand kovalent gebunden werden, kann ein stabiler Ligandenimmobilisierungsträger mit weniger Ligandenverlust synthetisiert werden.
- Da Zellulosepartikel den Basisträger bilden, ist es chemisch stabil.
- Abhängig vom Liganden ist es möglich, einen Ligandenimmobilisierungsträger mit hoher Adsorptionsmenge zu synthetisieren.
- Es hat dieselbe Porengröße wie handelsübliche 4 %-Agaroseträger und verfügt daher über eine hohe dynamische Adsorptionsmenge, selbst wenn polymere Liganden wie Proteine usw. immobilisiert werden.
- Bei diesem Träger sind Formylgruppen an ein Polysaccharid mit vielen Hydroxylgruppen angehängt, sodass er die Eigenschaft einer geringen unspezifischen Adsorption aufweist.
- Die Kopplung von Liganden ist unter milden Bedingungen in kurzer Zeit abgeschlossen, wodurch eine Deaktivierung des Liganden verhindert wird.
- Da Zellulosepartikel den Basisträger bilden, die bei hohen Temperaturen stabil sind, kann es auch aggressiven Reaktionen standhalten.
- Es behält seine Aktivierungsfähigkeit auch nach längerer Lagerung.
| Merkmale | |
|---|---|
| Basisträger | Vernetzte Zellulosepartikel |
| Ausschlussgrenze Molekulargewicht | 4.000kD |
| Durchschnittliche Partikelgröße | 125 - 210µm |
| Partikelform | Echt kugelförmig |
| Cellulosekonzentration | 0,7g/ml |
| Formänderung | Die Form ändert sich nicht, selbst wenn der pH-Wert oder die Ionenstärke des Puffers geändert wird. |
| Chemische Stabilität | Der Basisträger ist in 0,1 M HCl und 0,5 M NaOH stabil. Es ist außerdem beständig gegen viele organische Lösungsmittel. |
| Mechanische Festigkeit | Kann mit peristaltischen Pumpen und starken Rührbedingungen verwendet werden |
| Autoklav | Verfügbar |
| Menge an immobilisiertem Protein | 40 mg Protein/ml (variiert je nach Ligand und Reaktionsbedingungen) |
| Betriebsdruck | < 1 bar (15 psi) |
| Basisträger | Aktivierte Funktionsgruppe | Spacerlänge (Atome) | Konzentration funktioneller Gruppen (μmol/ml) |
|---|---|---|---|
| Zellulose | Formylgruppe | 8 | 15 - 20 |
Fließgeschwindigkeitseigenschaften
- Spalte
- 16 x 200mm
Anwendungsbeispiel
| Immobilisierter Ligand | Zu reinigendes Molekül |
|---|---|
|
|
Tablle 1Allgemeine Anwendungen von Cellufine-aktivierten Trägern
Antigenreinigung unter Verwendung von Antikörperimmobilisierungsträgern
Abb. 3 ist ein Beispiel für die Antigenreinigung im großen Maßstab. Durch die Immobilisierung von Anti-HBS-Antikörpern auf Cellufine Formyl konnte HBS (Hepatitis-B-Oberflächenantigen) mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute gereinigt werden. Selbst bei einer Beladungsmenge von über 3.000 l Plasma und einer Nutzungsdauer von über 30 Monaten kam es zu keiner größeren Verschlechterung und das Antigen konnte äußerst stabil gereinigt werden.
Um einen Ligandenimmobilisierungsträger zu synthetisieren, wurden 45 l Pferdeserum, das Anti-HBS-Antikörper enthielt, durch Ammoniumsulfat-Fällung konzentriert.
Danach wurde der Puffer durch 0,2 M Phosphorsäure (pH 7) und 0,1 M NaCl ersetzt.
Das in diesem Verfahren erhaltene antikörperhaltige Serum wurde mit 12 l Cellufine Formyl zur Reaktion gebracht.
Danach wurden 80 g Natriumcyanoborhydrid als Reduktionsmittel zugegeben und 24 Stunden lang bei 4 °C bis 8 °C zur Reaktion gebracht, um eine kovalente Bindung an den Träger herzustellen.
Der erhaltene Ligandenimmobilisierungsträger wurde mit dem verwendeten Puffer gewaschen und danach in eine Säule gefüllt.
(Die Humanserum-Beladungsprobe wird vor der Verwendung auf dieser Säule durch Zentrifugation, Ammoniumsulfat-Fällung und Gelfiltrationsträger vorbereitet.)
- Probe
- 1.200 Liter halbgereinigtes HBs Ag-positives menschliches Plasma
- Spalte
- 140 x 780mm (12 liters) Cellufine Formyl Horse Anti-HBs Ag
- Waschpuffer
- 0,1 M NaCl, 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,0
- Elutionspuffer
- 0,2 M Glycin/HCl, pH 3
- Fließrate
- 20 cm/h (während des Ladens/Waschens der Probe) 26 cm/h (während der Elution)
- Elutionsvolumen
- 14 L (85x konzentriert)
- Ertrag
- 87 %
- Reinheit
- 149 Mal
Beispiel für die Reinigung eines Lektinimmobilisierungsträgers
Abb. 4 zeigt ein Beispiel für die Reinigung des Glykoproteins RCA (Ricinus communis Agglutinin) durch Immobilisierung von Lektin (Concanavalin A = ConA) auf Cellufine Formyl. 50 mg ConA wurden in 1 ml einer Lösung suspendiert, die 0,1 M Acetatpuffer (pH 6,4), 1 mM MgCl2, 1 mM MnCl2, 1 mM CaCl2 sowie Methyl-α-D-Mannosid enthielt, und die gelöste Ligandenprobe wurde in 0,5 g (nasser Träger) Cellufine Formyl gegeben und über Nacht bei 4°C in Reaktion gebracht. Anschließend wurde Natriumcyanoborhydrid zugegeben und die Mischung über Nacht bei 4°C zur Reaktion gebracht, um eine kovalente Bindung herzustellen.
- Probe
- 66ml RCA(30mg/ml)
- Spalte
- 0,9 x 9mm (0,6ml) Cellufine Formyl immobilisiertes Con A
- Waschpuffer
- 0,1M NaCl
- Äquilibrierungs
puffer - 0,2 M Phosphatpuffer, pH 7,2
- Elutionspuffer:
- 0,2 M Methyl-α-D-Mannosid
- Fließrate
- 12cm/hr
Immobilisierungsmechanismus
Die auf Cellufine Formyl immobilisierte Formylgruppe (Aldehydgruppe) bildet mit der primären Aminogruppe von Proteinen eine Schiff'sche Base. Dann wird ein Reduktionsmittel (Natriumcyanoborhydrid, Natriumhydrid usw.) verwendet, um die Schiffsche Base zu reduzieren und eine starke kovalenten Bindung herzustellen. Tabelle 2 beschreibt eine gängige Immobilisierungsmethode.
Empfohlenes Reduktionsmittel
Cellufine Formyl benötigt ein Reduktionsmittel, um den Liganden stabil und kovalent zu binden. Bei der Auswahl eines Reduktionsmittels empfehlen wir eines, das den Proteinliganden nicht deaktiviert. Natriumborhydrid (NaBH4), Natriumcyanoborhydrid (NaCNBH3) und Trimethylaminoboran ((CH3)3 NBH3) usw. sind Reduktionsmittel, die sich lange Zeit bewährt haben und für den Einsatz geeignet sind. Jedes Reduktionsmittel kann in einer Menge von bis zu 10 mg/g nassem Träger verwendet werden. Bezüglich der Menge des Reduktionsmittels ist es notwendig, unter Berücksichtigung der Ligandenverlustmenge und der Aktivitätsrate nach den optimalen Bedingungen für den Liganden zu suchen.
Ligandenimmobilisierungsmethode
Die Reaktion der Immobilisierung eines Liganden auf Cellufine Formyl verläuft schnell. Bei Verwendung instabiler funktioneller Proteine als Liganden sind jedoch milde Reaktionsbedingungen erforderlich, um eine Proteindeaktivierung zu verhindern. Durch die Bestimmung der optimalen Reaktionsbedingungen anhand der Aktivität des Proteins als Indikator ist es möglich, einen hervorragenden Ligandenimmobilisierungsträger zu synthetisieren. Zu den Parametern während der Reaktion gehören unter anderem die pH-Bedingungen, die Reaktionszeit und die Reaktionstemperatur.
Die Kopplungseffizienz (Menge des immobilisierten Liganden im Verhältnis zur Ladungsmenge) und die Immobilisierungsmenge des immobilisierten Liganden (Konzentration des auf dem Träger immobilisierten Liganden) lassen sich anhand der Ligandenkonzentration, dem pH-Wert, der Reaktionstemperatur und der Reaktionszeit während der Kopplungsreaktion einfach anpassen. Bei der Verwendung im Industriemaßstab kann die Suche nach besseren Bedingungen für die Immobilisierungsreaktion zu einem kostengünstigen Verfahren führen.
| 1 | Nach dem Waschen des Trägers mit reinem Wasser einen Reaktionspuffer hinzufügen, der den Liganden enthält. |
| 2 | 1–2 Stunden rühren. |
| 3 | Reduktionsmittel hinzufügen. |
| 4 | 1–10 Stunden rühren. |
| 5 | Bei Verwendung eines schwachen Reduktionsmittels die nicht in Reaktion gebrachte Formylgruppe mit 0,2 M Tris/HCl (pH 7) oder 1 M Ethanolamin reduzieren. Bei Natriumborhydrid ist je nach Bedingungen eine Blockierung nicht erforderlich. |
| 6 | Mit dem zu verwendenden Puffer waschen. |
| 7 | In Säulen verpacken. |
Tabelle 2Typisches allgemeines Protokoll für die Ligandenkopplung mit Cellufine Formyl
Beispiel einer Antikörperreinigung unter Verwendung eines Antigenimmobilisierungsträgers
Die Menge des auf Cellufine Formyl immobilisierten Liganden nimmt tendenziell zu, wenn die Ligandenkonzentration während der Reaktion hoch ist. Wenn der gereinigte Ligand leicht verfügbar ist, können hohe Immobilisierungsmengen durch Reaktion hoher Konzentrationen des Liganden erreicht werden, wobei jedoch die Kopplungseffizienz tendenziell verloren geht. Allerdings sind gereinigte Liganden wie Proteine im Allgemeinen sehr teuer, und selbst mit einer geringen Immobilisierungsmenge lässt sich eine ausreichende Leistung erzielen.
In diesem praktischen Beispiel haben wir eine Säule zur Reinigung von Kaninchen-Anti-BSA-Antikörpern durch Immobilisierung von BSA (Rinderserumalbumin) erstellt. Indem die Menge an immobilisiertem BSA auf 3 mg/ml und die Immobilisierungseffizienz auf 98 % angepasst wurde, konnte eine Säule mit Priorisierung auf die Kopplungseffizienz hergestellt werden.
- Probe
- 24 ml Kaninchenserum nach Ammoniumsulfatfällung
- Spalte
- 14 x 34 mm Säule, Cellufine Formyl-BSA-Immobilisierungsunterstützung (5,2 ml)
- Äquilibrierungs
puffer - 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4
- Waschpuffer
- 0,05 M Phosphatpuffer, pH 7,4 / 0,5 M NaCl
- Elutionspuffer
- 0,2 M Glycin / HCl, pH 2,25
- Fließrate
- 27cm/hr
- Ertrag
- 27 mg Antikörper
- Grad der Verfeinerung
- 20 mal
5 g nasser Träger mit Cellufine Formyl wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7.1) gewaschen. Als nächstes wurden 5 ml BSA-Lösung mit einer Konzentration von 4 mg/ml zugegeben und 12 Stunden lang bei 25 °C in Reaktion gebracht. Nach dem Waschen mit Puffer wurden 5 ml 0,4 M Ethanolamin zugegeben und 4 Stunden lang bei 25 °C in Reaktion gebracht. Letztlich betrug die Menge an immobilisiertem BSA 3,0 mg/ml.
