Cellufine Phosphate | DNA 결합 단백질과 T7 RNA 중합 효소의 정제

항체 정제 친화성 크로마토그래피

Cellufine^TMPhosphate

mRNA 의약품의 합성효소가 되는 T7 RNA 중합효소 등 핵산 결합 단백질의 정제에 사용

Cellufine Phosphate는 효소나 핵산 결합성 단백질에 친화성을 보여 주는 크로마토그래피 충전제입니다. 진구형의 기계적 강도가 높은 셀룰로스 입자에 인산 에스터기를 고정화했습니다. mRNA 의약품의 합성효소가 되는 T7 RNA 중합효소는 핵산 결합 단백질이므로, Cellufine Phosphate를 이용해 효율적으로 정제할 수 있습니다.

Cellufine Phosphate의 리간드 구조 — Figure1 Cellufine Phosphate의 화학 구조

특징
베이스 캐리어	셀룰로오스 입자
리간드	인산 에스테르기
리간드 농도	0.3 - 0.8meq/ml
단백질 흡착량	≧ 20mg/ml-gel(리소자임)

T7 RNA 중합효소 정제 사례Purification of T7 RNA polymerase

T7 RNA 중합효소는 시험관 내 전사 합성에서 주형 DNA로부터 mRNA를 합성하는 데 사용되는 극히 중요한 RNA 합성효소입니다. 이 사례에서는 처음에 Cellufine MAX DEAE로 조정제한 후 Cellufine Phosphate로 친화성 정제를 실시하는 2단계 크로마토그래피 공정으로, 고순도 T7 RNA 중합효소를 정제했습니다.

T7 RNA 중합 효소 정제 크롬 그램 — Figure 2 Cellufine Phosphate에 의한 T7 RNA 중합 효소의 정제

Cellufine MAX DEAE로 정제한 후 Cellufine Phosphate로 정제합니다. 붉은색으로 표시된 EL2 분획물에 T7 RNA 중합효소가 축적되어 있습니다.

Table 2　컬럼 후 각 분획에서 T7 RNA 폴리머 라제의 회수율

분획	효소 활성 (Unit/protein)	효소 활성 회수율 (%)	단백질 회수율 (%)
로드 샘플	94043	100	100
통과 분획	2763	1.8	59.8
용출 분획	267034	70.2	24.7

Cellufine Phosphate를 이용해 컬럼을 정제한 후(Figure 1)의 효소 활성률과 단백질 회수율을 Table 1에서 볼 수 있습니다. 용출 분획에서 T7 RNA 중합효소의 활성도는 70.2%로 높은 회수율을 기록했습니다. 단백질 질량은 24.7%까지 감소한 데서 불순물이 효율적으로 제거된 것을 알 수 있습니다.

Figure 3　Cellufine Phosphate 정제 후 SDS-PAGE

1 : 라이세이트, 2 : 황안 침전, 3 : 셀 파인 MAX DEAE 용출 분획, 4 : 셀 파인 포스페이트 용출 분획, 5 : 시판 제어

Cellufine MAX DEAE 및 Cellufine Phosphate의 각 정제 프로세스에서 얻은 분획물을 활용해 SDS-PAGE로 정제도를 평가했습니다. 크로마토그래피의 각 공정에 따라 불순물이 제거되고 Cellufine Phosphate 단계에서는 거의 단일 밴드가 될 때까지 T7 RNA 중합효소를 정제할 수 있습니다

Cellufine Phosphate의 기공 특성

Cellfine Phosphate Pore size characteristics — Figure 2Calibration carves of Cellufine Phosphate and a conventional Cellulose phosphate.

제자리 세정(CIP) 안정성C.I.P. Stability test

Cellufine Phosphate는 0.2M NaOH 수용액에 안정적으로 재사용할 수 있습니다.

Cellufine Phosphate 반복 사용 시험 데이터, 0.2 M NaOH로 정치 세척 시험 — Figure3CIP condition : 0.2mol/L NaOH 3CV 0.05M phosphate buffer, pH7 5CV (repeat)

Cellufine Phosphate에 의한 DNA 결합 단백질 RusA D70N의 정제 데이터 — Figure4Use of Cellufine Phosphate in Rus A D70N purification

작동조건

컬럼: 1.6x10cm (20ml)
유속: 3ml/min( 90cm/h )
샘플: 7.5mg RusA D70N (헤파린 고정화 담체 정제 후의 샘플)
그라디언트: 200ml、　0.1Ｍ→1.3M NaCl in 50mM tris-HCl pH 8.0

SDS-PAGE

Gel: Novex 4-12%BT gel used with MES-SDS running buffer (Invitrogen)
레인 정보: 1:세포 제거 후 추출물 2:헤파린 고정화 담체에 미흡착 분획 3:헤파린 고정화 담체 흡착 분획 RusA 4-6:셀파인 포스페이트 흡착 후의 용출 분획 7:RusA 순품 샘플 8:마커 12:MW standard (Invitrogen)

참고문헌
Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 00, No. 00 1–8
Rachel Macmaster, Svetlana Sedelnikova, Patrick J. Baker, Edward L. Bolt1,Robert G. Lloyd1 and John B. Rafferty
RusA Holliday junction resolvase: DNA complexstructure—insights into selectivity and specificity
This data was carried by courtesy of Dr. Svetlana Sedelnikovaof the Sheffield university.

단백질의 분리 특성

Cellufine Phosphate는 소금 농도에 변화를 주면 단백질을 분리할 수 있습니다. 양이온 교환체와 같은 양상을 보입니다만, 일반적인 양이온 교환체보다 높은 소금 농도에서 용출되는 경향이 있습니다.

Cellufine Phosphate에서 단백질의 분리 패턴 — Figure5Separation of mixed sample

컬럼: ID 1.1 cm – H 10 cm
유속: 2 ml/min (126cm/h)
평형화 버퍼: 0.01M acetate buffer, pH4.8
용출 완충액: 0 → 1 mol/L NaCl 그라디언트

Cellufine^TMPhosphate

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