항체 정제 친화성 크로마토그래피

CellufineTMFormyl

단일클론항체, 다클론항체, 항원 단백질이나 펩타이드 등 리간드를 고정화할 때 이용해 주십시오.

기존에 사용한 아가로스 베이스의 리간드 고정화 담체는 베이스 담체가 부드러워서 산업용으로 사용되는 대형 컬럼에 충전하는 것이 어려웠습니다. 또한 CNBr을 리간드로 하는 담체는 리간드 고정화가 불안정하여 리간드 이탈의 우려가 있었습니다.
Cellufine Formyl은 포르밀기(알데히드기)가 극히 안정적이며, 공유 결합에 의한 단백질 리간드와 견고하게 반응할 수 있는 고정화용 담체입니다. 진구형용이며 단백질이 쉽게 들어가는 크기의 세공을 지니고 있기에 리간드 고정화용 담체로 가장 적합한 물성을 갖추고 있습니다. 또한 대형 컬럼에서 사용 가능한 기계적 강도를 지니고 있습니다.

특징Features

  • 실험실 규모뿐만 아니라 산업 규모로 사용 가능한 기계적 강도를 지녔기에 빠른 유속에서 사용할 수 있습니다.
  • 고정화 담체와 리간드는 공유 결합하므로, 리간드 누출이 적은 안정적인 리간드 고정화 담체를 합성할 수 있습니다.
  • 베이스 담체는 셀룰로스 입자이기에 화학적으로 안정되어 있습니다.
  • 리간드에 따라 다르지만 고기능의 흡착량을 지니는 리간드 고정화 담체를 합성할 수 있습니다.
  • 시판하는 4% 아가로스 담체와 세공 크기가 동일하기에 단백질 등의 고분자 리간드를 고정화해도 높은 동적 흡착량을 자랑합니다.
  • 수산기가 많은 다당류에 포르밀기를 도입한 담체이기에 비특이적 흡착이 적은 것이 특징입니다.
  • 리간드의 결합은 온화한 조건에서 단시간에 완료되므로 리간드의 비활성화를 막을 수 있습니다.
  • 고온에서 안정적인 셀룰로스 입자가 베이스 담체이기에, 가혹한 반응 조건에도 견딜 수 있습니다.
  • 장기간 보관해도 활성화 능력을 유지합니다.
특징
베이스 캐리어 가교 셀룰로오스 입자
배제 한계 분자량 4,000kD
평균 입자 크기 125 - 210µm
입자 형상 진구형
셀룰로오스 농도 0.7g/ml
형상 변화 버퍼의 pH나 이온 강도를 바꾸어도 형상이 변화하지 않습니다.
화학 안정성 베이스 담체는 0.1M HCl과 0.5M NaOH에 안정합니다. 또한 많은 유기 용매에 내성이 있습니다.
기계적 강도 페리 스태틱 펌프나 강한 교반 조건에서도 사용할 수 있습니다.
오토클레이브 사용 가능
단백질 고정화량 40mg protein/ml(리간드와 반응 조건에 따라 다름)
조작압 < 1 bar (15 psi)
베이스 캐리어 활성화 관능기 스페이서 길이(원자) 관능기 농도 (μmol/ml)
셀룰로오스 포르밀기 8 15 - 20

유속 특성Pressure / Flow Characteristics

Cellufine Formyl의 유속 특성 데이터
Figure1Pressure/flow characteristic of Cellufine Formy versus 4 % cross-linked agarose gel
컬럼
16 x 200mm
Cellufine Formyl의 리간드 구조
Figure2Partial structures of Cellufine activated supports

사용 예Applications

고정화 리간드 정제 대상 분자
  • 항체
  • 항원
  • 단백질 A, G, L
  • 렉틴
  • 사이토 카인
  • 효소
  • 항원
  • 항체
  • 항체
  • 당단백질
  • 사이토 카인 수용체
  • 효소 기질

Table 1General Applications of Cellufine Activated Supports

항체 고정화 담체를 이용한 항원 정제Antigen Purification

Figure 3은 대규모 항원 정제의 사례입니다. 항HBS 항체를 Cellufine Formyl에 고정화해 HBS(B형 간염 표면 항원)를 고순도, 고효율로 정제할 수 있었습니다. 3,000L의 혈장 이상의 주입량, 30개월 이상의 사용 기간에도 큰 열화 현상 없이 극히 안정적으로 항원을 정제할 수 있었습니다.

리간드 고정화 담체를 합성하기 위해 45L의 항HBS 항체를 지닌 말 혈청을 황산암모늄 침전법으로 농축했다. 그 후 0.2M 인산(pH 7), 0.1M NaCl로 완충액 치환했다. 해당 조작으로 얻은 항체를 포함한 혈청을 12L의 Cellufine Formyl에 반응시켰다. 그 후 나트륨 시아노보로하이드리드 80g을 환원제로 추가하고 4℃~8℃에서 24시간 반응시켜 담체에 공유 결합했다. 이를 통해 얻은 리간드 고정화 담체를 사용 완충액으로 세정한 후 컬럼으로 충전했다.
(주입 샘플의 사람 혈청은 이 컬럼에 사용하기 전 원심분리, 황산암모늄 침전, 겔 여과 담체를 통해 준비하고 있습니다.)

Cellufine Formyl에 의한 B형 간염 표면 단백질(HBS)의 정제 데이터, B형 간염 표면 단백질 항체를 고정화
Figure3Purification of hepatitis B surface antigen (HBs Ag) with Cellufine Formyl immobilized antibody
샘플
1200 liters semi-purified HBs Ag-positive human plasma
컬럼
140 x 780mm (12 liters) Cellufine Formyl Horse Anti-HBs Ag
세척 버퍼
0.1M NaCl, 0.2M 인산 완충액 (pH7.0)
용출 완충액
0.2M 글리신/HCl (pH 3)
유속
20cm/hr(샘플 로드/세정시) 26cm/hr(용출시)
용출 부피
14 L (85배 농축)
수율
87 %
순도
149배

렉틴 고정화 담체의 정제 사례RCA, Purification

렉틴(콘카나발린 A = ConA)을 Cellufine Formyl에 고정화해서 당단백질 RCA(ricinus communis agglutinin)를 정제한 사례를 Fig.4에서 볼 수 있다. 50mg의 Con A를 1ml의 0.1M 아세트산 완충액(pH 6.4), 1mM MgCl2, 1mM MnCl2, 1mM CaCl2, 메틸 α-D-만노사이드를 포함한 용액에 현탁 후 용해한 리간드 샘플을 0.5g(습윤 담체)의 Cellufine Formyl에 추가해 4℃로 밤새 반응시켰다. 그 후 나트륨 시아노보로하이드리드를 추가하고 4℃로 밤새 반응시켜 공유 결합했다.

Cellufine Formyl에 의한 RCA(ricinus communis agglutinin)의 정제 데이터, 렉틴(콘카나발린 A=ConA)을 고정화
Figure4Purification of Ricinus communis agglutinin (RCA) on Cellufine Formyl concanavalin A (Con A)
샘플
66ml RCA(30mg/ml)
컬럼
0.9 x 9mm (0.6ml) Cellufine Formyl 고정화 Con A
세척 버퍼
0.1M NaCl
평형화 버퍼
0.2M 인산염 완충액 (pH 7.2)
용출 완충액:
0.2M 메틸-α-D-만노사이드
유속
12cm/hr

고정화의 메커니즘A GENERAL SUPPORT FOR PROTEINS Cellufine Formyl

Cellufine Formyl에 고정화된 포르밀기(알데히드기)는 단백질의 1급 아미노기와 시프 염기를 형성합니다. 이어서 환원제(나트륨 시아노보로하이드리드. 수소화 붕소 나트륨 등)를 사용해, 시프 염기를 환원하여 견고한 공유 결합을 형성합니다. Table 2에서는 일반적인 고정화 방법을 나타냅니다.

Cellufine Formyl의 고정화 반응 메커니즘
Figure5Cellufine Formyl Reaction Mechanism

권장 환원제Reducing Agents

Cellufine Formyl은 리간드를 안정적으로 공유 결합하기 위해 환원제가 필요합니다. 환원제를 선정하는 경우 단백질 리간드를 비활성화시키지 않는 환원제를 권장합니다. 수소화 붕소 나트륨(NaBH4), 나트륨 시아노보로하이드리드((NaCNBH3)), 트리메틸아민보란((CH3)3NBH3) 등은 사용한 실적도 많아 적합하게 사용할 수 있는 환원제입니다. 모든 환원제를 10mg/g-습윤 담체 이하에서 사용할 수 있습니다. 환원제 양은 리간드 누출량, 활성률을 고려하면서 리간드에 가장 적합한 조건을 탐색해야 합니다.

리간드 고정화 방법Coupling with Formyln

Cellufine Formyl에 리간드를 고정화하면 신속하게 반응이 진행됩니다. 하지만 불안정한 기능성 단백질을 리간드로 하는 경우, 단백질의 비활성화를 막기 위해 온화한 반응 조건을 형성해야 합니다. 단백질의 활성을 지표로 하여 최적의 반응 조건을 결정함으로써 뛰어난 리간드 고정화 담체를 합성할 수 있습니다. 반응 시 파라미터로는 pH 조건, 반응 시간, 반응 온도 등을 들 수 있습니다.

결합 효율(투입량에 대해 고정화된 리간드 양)이나 고정화된 리간드의 양(담체에 고정화된 리간드 농도)은 결합 반응 시 리간드 농도, pH, 반응 온도, 반응 시간으로 쉽게 조정할 수 있습니다. 산업 규모에서 사용하는 경우, 더 좋은 고정화 반응 조건을 탐색하여 비용 대비 성능이 뛰어난 프로세스를 구축할 수 있습니다.

1 담체를 순수로 세정한 후 리간드를 포함한 반응 완충액을 추가한다.
2 1~2시간 교반한다.
3 환원제를 추가한다.
4 1~10시간 교반한다.
5 약한 환원제를 사용하는 경우 0.2M Tris/HCl (pH 7) 또는 1M 에탄올아민으로 미반응 포르밀기를 환원한다. 수소화 붕소 나트륨의 경우 조건에 따라선 블로킹 처리는 불필요하다.
6 사용하는 완충액 등으로 세정한다.
7 컬럼에 충전한다.

Table 2Typical general protocol used for ligand coupling with Cellufine Formy

항원 고정화 담체를 이용한 항체 정제 사례Antibody Purification

Cellufine Formyl에 리간드가 고정화되는 양은 반응 시 리간드 농도가 높은 경우 많아지는 경향이 있습니다. 정제된 리간드를 쉽게 입수할 수 있는 경우 고농도 리간드를 반응시켜 고정화 양을 높일 수 있지만, 결합 효율은 저하되는 경향이 있습니다. 하지만 일반적으로는 정제된 단백질 등의 리간드는 매우 고가이며, 고정화 양이 적어도 충분한 성능을 발휘하는 경우도 있습니다.

이 사례에서는 BSA(소 혈청 알부민)를 고정화해 토끼 항 BSA 항체를 정제하는 컬럼을 제작했습니다. BSA 고정화 양은 3mg/ml로 적게 하고 고정화 효율을 98%로 하여 결합 효율을 우선시한 컬럼을 제작했습니다.

Cellufine Formyl에 의한 항BSA 폴리클로날 항체의 정제 데이터, BSA(bovine serum albumin)를 고정화
Figure6Purification of rabbit anti-bovine serum albumin (BSA)antibody with Cellufine Formyl BSA
샘플
24ml 황안 침전 후 래빗 혈청
컬럼
14 x 34mm 컬럼, Cellufine Formyl BSA 고정화 담체 (5.2ml)
평형화 버퍼
0.05M 인산염 완충액 (pH 7.4)
세척 버퍼
0.05M 인산 완충액 (pH 7.4)/0.5M NaCl
용출 완충액
0.2M 글리신/HCl (pH 2.25)
유속
27cm/hr
수율
27mg 항체
정제도
20배

5g 습윤 담체의 Cellufine Formyl을 0.1M 인산 완충액(pH 7.1)으로 세정한다. 이어서 4mg/ml 농도의 BSA 용액을 5mL 추가해 25℃에서 12시간 반응시켰다. 완충액으로 세정한 후 5mL의 0.4M 에탄올아민을 추가해 25℃에서 4시간 반응시켰다. 최종적으로 BSA의 고정화 양은 3.0 mg/ml였다.

커스터마이징·주문 제작
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고객님의 요청에 따른 등급의 개발도 가능하오니 상담해 주시기 바랍니다.

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