亲和层析填料

CellufineTMPhosphate

用于纯化核酸结合蛋白，例如 T7 RNA 聚合酶，它是一种合成 mRNA 药物的酶

　　Cellufine Phosphate是一款亲和填料，旨在浓缩，纯化蛋白以及与核酸相关的蛋白质之类的酶。 填料是将磷酸酯配基固定在具有良好刚性的纤维素微球上而成。 由于 T7 RNA 聚合酶是 mRNA 药物的合成酶，是一种核酸结合蛋白，因此可以通过细胞细磷酸盐高效纯化。

Cellufine Phosphate的配体结构
Figure1Partial Structure of Cellufine Phosphate
特征
基质 纤维素微球
配基 磷酸酯
配基密度 0.3 - 0.8meq/ml
吸附容量 ≧ 20mg/ml-gel (溶菌酶)

T7 RNA聚合酶纯化实例 Purification of T7 RNA polymerase

T7 RNA 聚合酶是一种关键的 RNA 合酶，用于在体外转录合成中从模板 DNA 合成 mRNA。 在这种情况下，高纯度T7 RNA聚合酶通过两步层析步骤纯化， 首先用Cellufine MAX DEAE进行粗纯化，然后用Cellufine Phosphate进行亲和纯化。

使用 Cellufine Phosphate 纯化 T7 RNA 聚合酶
Figure 2 使用 Cellufine Phosphate 纯化 T7 RNA 聚合酶

用 Cellfine MAX DEAE 纯化后，用 Selfainfosphate 纯化。用红色标示的EL2馏分是T7 RNAP的区划。

Table 2　柱后每个馏分中 T7 RNA 聚合酶的回收率
馏分 酶活性
(Unit/protein)		 酶活性回收率
(%)		 蛋白质回收率
(%)
装载液 94043 100 100
通过 2763 1.8 59.8
洗脱馏分 267034 70.2 24.7

表1显示了使用 Cellufine Phosphate进行柱纯化后的酶活性和蛋白质回收率。 从表中可知，洗脱馏分上的T7-RNAP的活性为70.2%，回收率很高，而蛋白质量已减少到24.7%，由此可知杂质杂质杂质已被高效去除。


Cellufine Phosphate 纯化后的 SDS-PAGE
Figure 3　Cellufine Phosphate 纯化后的 SDS-PAGE

1:　溶菌、2:　硫酸铵沉积、3:　Cellufine MAX DEAE 洗脱馏分、4: Cellufine Phosphate 洗脱馏分、5:　市售对照标准

利用从Cellufine MAX DEAE和Cellufine Phosphate的各精制工序中得到的馏分，然后用SDS-PAGE对精制进行评价。 每经过一个层析工序，杂质杂质就会被去除，而在用Cellufine Phosphate精制的阶段，精制得到的T7 RNAP纯度几乎达到单频带，非常高。

Cellufine Phosphate的细孔特性

Cellufine Phosphate的细孔特性
Figure2Calibration carves of Cellufine Phosphate and a conventional Cellulose phosphate.

稳定性试验

　　用碱液在线清洗Cellufine Phosphate依然具有良好的稳定性（C.I.P）

Cellufine Phosphate的反复使用试验数据、用0.2 M NaOH进行的定置清洗试验
Figure3CIP condition : 0.2mol/L NaOH 3CV 0.05M phosphate buffer, pH7 5CV (repeat)
使用Cellufine Phosphate的DNA结合蛋白质RusA D70N 的纯化数据
Figure4Use of Cellufine Phosphate in Rus A D70N purification

色谱分析

层析柱
1.6x10cm (20ml) 装填 Cellufine Phosphate
流速
3ml/min( 90cm/h )
样品
7.5mg经肝素琼脂糖填料纯化后的RusA D70N
梯度
200ml 50mM tris-HCl pH 8.0，氯化钠浓度从0.1-1.3M

聚丙烯酰胺凝胶电泳

凝胶
4-12%浓度的梯度胶，使用MES-SDS缓冲液(Invitrogen)
电泳胶顺序
1 细胞提取液
2 肝素琼脂糖层析柱流穿
3 肝素琼脂糖纯化样
4-6 Cellufine Phosphate纯化样
7 RusA标准对照样
8 Mark 12 对照分子量标准品 (Invitrogen)

文献编号及出处
Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 00, No. 00 1–8
Rachel Macmaster, Svetlana Sedelnikova, Patrick J. Baker, Edward L. Bolt1,Robert G. Lloyd1 and John B. Rafferty
RusA Holliday junction resolvase: DNA complexstructure—insights into selectivity and specificity
这个数据由谢菲尔德大学的Dr. Svetlana Sedelnikovaof博士提供

使用Cellufine Phosphate的蛋白质的分离类型
Figure5Separation of mixed sample
层析柱
直径 1.1 cm – 柱高 10 cm
流速
2 ml/min (126cm/h)
缓冲液
0.01M 乙酸缓冲液, pH4.8
洗脱
0 to 1 mol/L 氯化钠梯度洗脱
CellufineTMPhosphate

特殊定制

可根据客户需求承接特定填料的可开（商談）

咨询
Back to Top