亲和层析填料
Cellufine™ Formyl

活化的载体填料可用于固定抗体、抗原、亲和配体和酶

  随着工艺规模亲和层析的发展,对能够适应工业环境的新型的可支持偶联化学的基质填料的需求也在不断增加。 基于琼脂糖的经典偶联载体填料在大规模化上表现较差原因有几个。它们在大型色谱柱中提供的流动性能较差。 广泛使用的溴化氰偶联化学方法在结合稳定性和非特异性吸附方面存在着己被文献充分证明了的问题。 此外,即使采用更现代的化学方法,琼脂糖也会脱落多糖链,在温和的操作条件下也会导致配体大量流失。
  被活化了的Cellufine偶联载体填料,可在生产工艺规模上毫不费力地提供最先进的实验室级的性能。 该产品可专门为亲和色谱提供优化了的具有非常大孔径的可偶联高配体容量的刚性球形纤维素基珠, 不但在大型色谱柱中具有高流速,而且纤维素主链的非特异性吸附也非常低并且没有琼脂糖配体流失的泄漏问题。



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特徴

 

► 实验室和工艺柱均可实现高流速下的高容量

► 偶联载体和基质填料的化学结构非常稳定,配体泄漏率低

► 优异的机械,化学和环境耐受性

► 高配体吸附能力

► 由于孔径大小与4%偶联琼脂糖介质相当,因此与高分子量配体和目标蛋白兼容

► 未反应的甲酰基在还原过程中容易转化为中性羟基,从而降低了非特异性吸附

► 内置亲水性间隔臂,可实现最大的配体可及性和较低的非特异性吸附

► 长时间混合不会造成填料损坏或产生细粉,从而允许使用简单的偶联设备

► 配体偶联在温和条件下以较短的反应时间进行

► 填料的热稳定性允许反应在高温下进行

► 未使用的载体填料可长期保质


特性
基质 交联纤维素
分子排阻极限 4,000kD
标准粒径 125 - 210µm
粒子形状 球形
密度 0.7g/ml 湿重
收缩率 / 澎胀 在pH或离子强度变化下不会明显收缩或澎胀
化学耐性 可与任何盐,非离子型洗涤剂,有机溶剂一起使用。 耐0.1M HCl和0.5M NaOH。 (注意:在这些条件下偶联的配体可能不稳定)
机械耐性 可以承受蠕动泵吸胶和长时间混合
可高圧灭菌 可在pH7,121°C下高温高圧灭菌30分钟
饱和容量 取决于蛋白质和条件,最高可偶联40 mg蛋白/ ml
运行压力 < 1 bar (15 psi)
已提供的配基 甲酰基0.01%2,2-硫代双(吡啶-1-氧化物)

偶联配基 活性基团 配基臂长
(原子)
密度(mol/ml)
甲酰基 醛基 8 15 - 20


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压力 / 流速 特性


Figure1
层析柱: 16 x 200mm

Figure2


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应用


活化的偶联配基 固定分子 目标分子
Cellufine Formyl 抗体
抗原
蛋白A,G
凝集素
细胞因子
抗原
抗体
抗体
碳水化合物 糖蛋白
受体
底物/产物
table1


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抗原纯化

 

  图3展示了一个为了大规模纯化抗原将抗体偶联到Cellufine Formyl上的应用例子。在此应用中,依靠这样偶联的Cellufine亲和层析柱可高效率高浓度的纯化了抗原。这只色谱柱已经使用了30多个月,处理了3,000升以上的初始血浆,而性能依然没有明显下降。

 

  为了生产凝胶,首先浓缩45升含有抗HBs Ag抗体的马血清,并通过硫酸铵沉淀进行纯化, 然后用0.1 M NaCl透析至0.2M磷酸盐(pH 7)中。将得到的抗体血清添加到12升的Cellufine Formyl中,并与80克NaCNBH3在4至8°C下反应24小时。 然后将抗体凝胶用缓冲液洗涤并填充到柱中。工艺流程由对HBs Ag呈阳性的人血浆组成,该血浆已预先通过冻融,离心, 硫酸铵沉淀和凝胶过滤色谱法纯化。


Figure3
样品: 1200 liters semi-purified HBs Ag-positive human plasma
层析柱: 140 x 780mm (12 liters) Cellufine Formyl Horse Anti-HBs Ag
开始 / 冲洗 0.1M NaCl, 0.2M phosphate
缓冲液: (pH 7) wash volume 200 liters
洗脱液: 0.2M glycine/HCl (pH 3)
流量: 20cm/hr loading/washing 26cm/hr elution
产品数量: 14 liters (85 x concentration)
收率: 87 %
单一步骤:  
纯化: 149 x


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RCA纯化

 

  可使用Cellufine Formyl固定化凝集素以进行糖蛋白纯化,如图4所示。 将Con A(50mg)固定在0.5g(湿润)Cellufine Formyl上,方法是在4°C下与1ml 0.1M乙酸盐(pH 6.4)反应过夜。 在甲基-α-D-甘露糖苷和NaCNBH3存在下含有1mM MgCl2、1mM MnCl2和1mM CaCl2。 用水洗涤后, 将凝胶在4°C悬浮于2ml含NaCNBH3的1%戊二醛中过夜。 第二次水洗后,将凝胶在室温下悬浮于2ml 1M Tris/HCl(pH 7.4)中一小时, 然后重新洗涤。


Figure4
样品: 66ml RCA1 (30mg/ml 蛋白)
层析柱: 0.9 x 9mm (0.6ml) Cellufine Formyl Con A
初始 / 冲洗 0.1M 氯化钠
缓冲液: 0.2M 磷酸盐 (pH 7.2)
洗脱液: 0.2M 甲基-α-D-甘露糖苷
流量: 12cm/hr


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活性载体的功能选择

 

  甲酰基官能团的可用性为选择最佳反应条件(pH,温度,活化剂,反应物浓度等)的介质提供了极大的灵活性。 Cellufine甲酰是针对应用组优化的高稳定性,功能性填料。 反应化学和配体密度的控制很简单。



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蛋白质的一般偶联

 

  Cellufine Formyl填料上的醛基活性基团与配体上的伯胺基反应形成不稳定的Schiff’s base偶联物(见图5), 再用温和的还原剂将其转化为高度稳定的最終偶联产物。表2说明了一般的配体偶联方案。


Figure5


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还原剂

 

  Cellufine Formyl需要还原剂才能形成高度稳定的键合。几乎在任何应用中都可以使用多种还原剂以获得良好的效果。 该试剂的选择应该以产生合理的反应速率,但又不要太强以至于损害蛋白质配体(例如通过还原二硫键)或还原醛基。 出于这些特殊的要求,硼氢化钠(NaBH4),氰基硼氢化钠(NaCNBH3)和更新的无毒还原剂三甲胺硼烷((CH3)3NBH3)是成功的试剂选择。 对于任何试剂,所需量通常小于每克湿凝胶10毫克。



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与甲酰基偶联

 

  Cellufine Formyl的反应速率不但足够快以至实用,又能够缓慢温和的适应与大多数蛋白质的反应。 它还允许进行精细的控制,可以随温度有效地控制该速率以实现偶联蛋白质的最大稳定性。有效偶联的pH值在3到10之间。

 

  通过改变偶联配体浓度,pH和温度,可以很容易地改变和优化偶联效率(偶联量与提供量之间的比率)和总配体密度。 在大多数情况下,一组标准的条件将很好地起作用,但是可以在广泛的范围内进行优化以提高特定应用的工艺经济性。


1 用水冲洗偶联介质并过滤。 用偶联缓冲液匀浆含配体偶联介质。
2 搅拌或摇晃半至两小时。
3 添加还原剂。
4 搅拌或摇晃6至10小时。
5 用0.2M Tris / HCl(pH 7)或1M乙醇胺在缓冲液中用还原剂洗涤,以淬灭残留的醛。 搅拌或摇晃3至5小时。
6 先用色谱洗脱缓冲液洗涤,再用起始缓冲液洗涤。
7 Pack and run column.
table2



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抗体纯化

 

  配体与活化凝胶的偶联优化通常涉及吸收效率(实际偶联反应中提供的配体分数)和最终配体负载量 (每毫升凝胶偶联的配体毫克数)之间的权衡。当纯化的配体容易获得时,可以以低偶联效率为代价生产高负载的凝胶。 然而,在更常见的情况下,即使以低负载为代价,纯化的配体也是非常宝贵的,并且非常需要良好的偶联效率。在某些情况下, 低配体密度也可以提高结合特异性。

 

  在Cellufine Formyl的醛化学中缺乏竞争性水解反应,这使得对加料量和效率的精细控制变得非常简单。 在该实施例中,将高纯度牛血清白蛋白用作纯化兔抗BSA抗体的抗原。偶联反应的设计具有很高的效率(98%)和相对较低的配体密度。


Figure8
样品: 24ml 沉淀兔抗血清
层析柱: 14 x 34mm Cellufine Formyl BSA (5.2ml)
开始 / 清洗: 0.05M 氯化钠 (pH 7.4)
缓冲液: /0.5M NaCl
洗脱: 0.2M 甘氨酸 / 盐酸 (pH 2.25)
流量: 27cm/hr
收率: 27mg 抗体
单一步骤:  
纯化: 20 x

  通过用0.1M磷酸缓冲液(pH 7.1)洗涤5g凝胶(湿重),添加5ml 4mg / ml BSA并在25°C下搅拌12小时来制备Cellufine Formyl BSA。用缓冲液洗涤后,将凝胶悬浮在5ml含有0.4M乙醇胺的缓冲液中。 在25℃下搅拌4小时后,用缓冲液洗涤凝胶。 偶联的BSA为约3.0mg / ml凝胶。


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